Cell︱手牵手，共进退！小胶质细胞之间形成细胞连接网络携手降解病理性α-syn

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撰文︱Sucre

责编︱王思珍

α-突触核蛋白（α-synuclein，α-syn）是由SNCA基因编码的、分子量为14kD的小分子蛋白质，在中枢神经系统中高表达，并且主要分布在突触前神经末梢。生理状态下，α-syn是一种可溶性蛋白质，在水溶液中无特定结构【1】。病理状态下，α-syn低聚化并聚集，形成路易小体（Lew bodies，LB）和路易突起（Lewy neurites，LN），LB和LN的形成是多种神经退行性疾病的典型病变，其中包括帕金森病（Parkinson Disease，PD），路易小体痴呆（Dementia with Lewy bodies，DLB）和多系统萎缩（Multiple System Atrophy，MSA）等【2】。此外，SNCA基因突变或过表达α-syn均可引起病理性α-syn聚集并导致多巴胺能神经元死亡缺失和机体运动障碍【3】。

多项研究表明，在体内（in vivo）和体外（in vitro）条件下，病理性的α-syn能够在细胞之间传播，并推动疾病的发展进程【4-5】。因此，提升病理性α-syn的清除效率和降低病理性α-syn的聚集可能是一种治疗PD等突触核蛋白病（synucleinopathies）的有效途径。

小胶质细胞（microglia），作为中枢神经系统的主要免疫细胞，在介导炎症反应、维持脑内稳态、清除细胞碎片以及提供神经营养因子等方面发挥了重要作用【6】。同时研究发现，在多种突触核蛋白病患者的脑内，病理性α-syn聚集往往伴随着小胶质细胞的活化，说明小胶质细胞参与α-syn的病理过程【7】。目前，人们虽然针对小胶质细胞参与α-syn清除的研究已经做了诸多工作，然而，遗憾的是，人们尚不清楚小胶质细胞在α-syn清除中的作用机制。

2021年9月22日，来自德国波恩大学医学中心、德国神经退行性疾病中心和麻省大学医学院的Michael T. Heneka团队在Cell上发表了题为“Microglia jointly degrade fibrillar alpha-synuclein cargo by distribution through tunneling nanotubes”的最新研究论文。研究发现小胶质细胞之间通过形成F-肌动蛋白（F-actin）依赖的细胞连接网络，实现病理性α-syn在小胶质细胞之间转移，并促进病理性α-syn降解和清除。

文中，作者首先研究了小胶质细胞对病理性α-syn的吞噬（即清除）能力和病理性α-syn对小胶质细胞转录组的影响。为此，作者通过细胞免疫化学和流式细胞术确认小胶质细胞能够摄取荧光标记的α-syn原纤维，并且这一过程可以被吞噬作用抑制剂CytD显著抑制。接着，作者分析了α-syn原纤维对小胶质细胞转录水平的影响，结果发现，相比未处理细胞，α-syn原纤维处理的小胶质细胞共有2189个差异表达基因，其中687个基因表达上调，1502个基因表达下调。进一步地，作者通过GO（gene ontology）分析和BINGO（Biological Network Gene Ontology tool）分析工具，发现差异表达基因与炎症反应和细胞程序性死亡密切相关。因此，这些结果表明，α-syn原纤维能够被小胶质细胞吞噬，并引起小胶质细胞炎症相关基因和凋亡相关因表达上调（图1）。

图1 吞噬α-syn原纤维引起小胶质细胞炎症反应和凋亡通路相关基因表达

（图引自：Scheiblich H, et al. Cell. 2021）

接着，作者研究了小胶质细胞摄取α-syn后的降解机制。首先，作者通过细胞免疫化学、流式细胞分选和免疫印迹技术发现，处理24h后，仍有40%-50%的α-syn原纤维位于小胶质细胞内尚未降解。进一步地，细胞免疫化学结果显示，小胶质细胞之间形成F-actin阳性的细胞连接网络，这些结构虽长度不一、粗细各异，但都含有α-syn原纤维。进一步地，电镜结果显示，相邻小胶质细胞的细胞膜相互接触，并伴随多种细胞器的参与。为了实时观察这一过程，作者采用延时拍摄方法，发现通过两种不同类型的转运机制，实现小胶质细胞之间α-syn原纤维转移，其一：细胞之间形成短且粗的连接结构，在40-60分钟之间实现细胞间大的α-syn原纤维转移；其二：细胞之间形成长且细的连接结构，在3分钟左右实现细胞间小的α-syn原纤维转移。值得一提的是，α-syn处理的小胶质细胞比未经处理的小胶质细胞形成的细胞连接网络明显要多。这些结果说明：小胶质细胞之间通过形成连接网络，实现α-syn原纤维在细胞间转移（图2）。

图2 α-syn原纤维促进小胶质细胞间连接网络形成

（图引自：Scheiblich H, et al. Cell. 2021）

随后，作者深入研究了α-syn原纤维在小胶质细胞之间转运的分子机制。为此，作者将含有荧光标记α-syn的供体细胞和CellTracer标记的受体细胞进行共培养，培养5小时后发现，与供体细胞形成直接接触的受体细胞中，平均8%的细胞变成α-syn阳性，并伴随供体细胞α-syn原纤维减少，表明α-syn原纤维能够在临近小胶质细胞之间转移，并导致α-syn原纤维重新分布。接着，作者对受体细胞和供体细胞的细胞骨架进行分析，发现二者发生了类似的变化，具体表现为细胞分支增多、增长。与此同时，通过GO分析发现，α-syn处理的小胶质细胞Rho信号转导水平升高。已有大量证明表明Rho激酶ROCK通过调节下游肌动球蛋白复合物参与调节细胞骨架的发生。接着，作者利用ROCK选择性抑制剂Y-27632处理细胞，结果发现Y-27632明显促进供体细胞将α-syn原纤维向受体细胞转移，同时，利用激球蛋白II抑制剂Blebbistatin处理细胞，同样显著促进α-syn原纤维的转移，并伴随细胞连接网络形成增多。截然不同的是，利用F-肌动蛋白翻转抑制剂CytD则显著抑制α-syn原纤维在细胞之间的转移，并伴随细胞连接网络形成受阻。细胞免疫组化结果表明，供体细胞和受体细胞之间形成的网络连接呈现细胞骨架标记蛋白阳性，即肌球蛋白II和F-肌动蛋白阳性。最后，作者通过敲除实验，发现敲除ROCK1不影响α-syn原纤维在小胶质细胞之间的转移，而敲除ROCK2则显著促进α-syn原纤维在小胶质细胞之间的转移。这些综合结果表明，小胶质细胞摄取α-syn原纤维后，通过激活Rho信号通路，调节下游肌动球蛋白复合物的形成，促进α-syn原纤维在细胞之间转移（图3）。

图3 α-syn原纤维在小胶质细胞之间转移依赖于F-肌动蛋白

（图引自：Scheiblich H, et al. Cell. 2021）

再接着，作者研究了细胞间α-syn原纤维转移对小胶质细胞基因表达的影响。首先，作者将含有荧光标记α-syn的供体细胞和CellTracer标记的受体细胞进行共培养，随后在不同时间点，进行流式细胞分选及RNA测序，分别计算二者皮尔森系数ρ并作为转录组相似性比较的依据。结果发现，随着共培养时间延长，二者转录组相似度逐渐接近，即供体细胞的转录谱逐渐接近受体细胞的转录谱。同时，作者比较了供体细胞和受体细胞各自共培养前后的转录谱，结果发现，供体细胞起初丰富表达的差异表达基因，包括炎症相关基因和凋亡相关基因，随着共培养时间延长，上述基因表达水平都逐渐下调；而受体细胞在共培养前后，转录谱没有明显差异。这些结果说明，细胞间α-syn原纤维转移能够下调小胶质细胞炎症相关基因的表达（图4）。

图4 细胞间转移α-syn原纤维下调小胶质细胞炎症相关基因表达

（图片引自：Scheiblich H, et al. Cell. 2021）

进一步地，作者研究了细胞间α-syn原纤维转移对小胶质细胞功能的影响。首先，作者发现，利用α-syn原纤维处理小胶质细胞破坏细胞膜完整性，并导致细胞死亡。有趣的是，供体细胞和配体细胞共培养，极大地保护了供体细胞膜的完整性，有效阻止了SYTOX渗入细胞，同时不影响受体细胞膜的完整性。与此同时，作者发现供体细胞的浓缩型线粒体数量增多、线粒体网络结构分解，进而导致活性氧（ROS）产生增多。接着，作者探究了ROS在α-syn原纤维再分布中的作用。结果发现，利用ROS清除剂NAC（N-Acetylcystein，N-乙酰半胱氨酸）可以显著抑制细胞之间的α-syn原纤维转移，相反，利用H₂O₂处理细胞可以有效翻转上述现象。这些结果说明：ROS可能影响α-syn原纤维在细胞间的转移。

接着，作者利用MitoTracker标记受体细胞的线粒体，并记录其在共培养过程中随时间推移的动态变化。结果发现，细胞共培养5小时后，MitoTracker阳性的供体细胞数量显著增多，细胞免疫化学结果也证实MitoTracker阳性线粒体和α-syn原纤维在细胞间形成的网络中出现。类似地，供体细胞的线粒体也可以向受体转移。此外，转录组分析发现，共培养后供体细胞的固有凋亡信号通路相关基因（线粒体功能异常）表达下调。这些结果说明，小胶质细胞间α-syn原纤维转移的同时伴随线粒体交换。

已有的研究表明，LRRK2 基因G2019S突变是导致PD最常见的遗传因素，且LRRK2基因与线粒体功能异常密切相关。因此，接着，作者利用WT小鼠和LRRK2 G2019S突变小鼠，比较了二者小胶质细胞在应对α-syn原纤维挑战时耗氧量和ROS产量方面的差异。结果发现，LRRK2 G2019S小胶质细胞线粒体的耗氧量、线粒体循环率和ROS产量都明显低于野生型（WT）的小胶质细胞线粒体。同时，LRRK2 G2019S小胶质细胞间的α-syn转移受阻。接着，作者试图利用WT小胶质细胞通过重新分布功能性线粒体的方法，挽救LRRK2 G2019S小胶质细胞功能。为此，作者将WT和LRRK2 G2019S小胶质细胞通过不同形式的组合进行共培养。结果发现，WT小胶质细胞作为受体细胞可有效减少供体细胞（WT或LRRK2 G2019S小胶质细胞）ROS产量并伴随线粒体有效交换，而LRRK2 G2019S小胶质细胞作为受体细胞无法有效减少供体细胞（WT或LRRK2 G2019S小胶质细胞）ROS产量并伴随线粒体交换障碍。这些结果表明，LRRK2 G2019S突变可能通过阻碍病理性α-syn转移和线粒体交换导致家族性PD（图5）。

图5 细胞间α-syn原纤维转移的同时伴随线粒体交换，功能性线粒体转移降低ROS水平、帮助细胞免于细胞毒性和死亡

（图片引自：Scheiblich H, et al. Cell. 2021）

随后，为进一步阐明上述α-syn的转移机制，作者将CellTracer标记的含有α-syn的原代小胶质细胞注射到器官型培养脑片中，共培养24小时后，注射的小胶质细胞和脑片中的小胶质细胞形成了多种连接。更有趣的是，作者发现，脑片中的小胶质细胞中含有α-syn原纤维，证明小胶质细胞之间发生α-syn的转移。此外，作者将CellTracer标记的含有α-syn的原代小胶质细胞注射到Cx3xr1^GFP+/-小鼠的大脑皮层，利用双光子显微镜进行活体成像。结果发现，在注射位点附近，注射的小胶质细胞和GFP阳性小胶质细胞之间形成多种细胞连接，更重要的是，作者通过延时成像发现，含有α-syn的细胞分支向邻近的细胞延伸并形成连接。这些结果表明，在体条件下α-syn原纤维也能够在小胶质细胞之间转移（图6）。

图6 体内条件下，α-syn原纤维在小胶质细胞之间转移

(图片引自：Scheiblich H, et al. Cell. 2021)

文章最后，作者通过DLB和MSA患者死后脑组织的样本，发现部分小胶质细胞中有聚集性的α-syn，值得一提的是，许多这样的细胞和含有聚集性α-syn的细胞形成连接。这一结果促使作者推测：病理性的α-syn可能在患者的小胶质细胞之间传播。为此，作者将分离的外周血单核细胞（PBSCs）诱导分化形成巨噬细胞/小胶质细胞，并进行验证。接着，作者发现，相比健康对照组来源并诱导分化的小胶质细胞，DLB患者来源并诱导分化的小胶质细胞之间转移α-syn原纤维的能力显著偏低。这些结果表明，病理性α-syn能够在人小胶质细胞之间传播，并且DLB患者的小胶质细胞对病理性α-syn的转移能力显著下降（图7）。

图7 人组织中，α-syn原纤维在人小胶质细胞之间转移

（图片引自：Scheiblich H, et al. Cell. 2021）

图8 总结图：小胶质细胞响应病理性α-syn的双重补救措施

(图片引自：Scheiblich H, et al. Cell. 2021)

文章结论与讨论，启发与展望

作为中枢神经系统的重要免疫细胞，小胶质细胞通过模式识别受体（pattern recognition receptor）响应细胞内的错误折叠蛋白，并介导炎症反应【8, 9】。然而，一直以来，人们尚不清楚小胶质细胞降解病理性α-syn的分子机制。这篇研究工作的出现，给我们提供了新的认识。

首先，小胶质细胞之间通过形成F-激动蛋白依赖的功能性细胞连接网络，实现病理性α-syn在小胶质细胞之间进行转移，一方面可以降低受累细胞的病理性α-syn水平、缓解炎症反应和细胞毒性，另一方面可以加速病理性α-syn降解和促进细胞存活。

此外，文章发现WT小胶质细胞之间同时可以进行线粒体交换，并能有效缓解ROS引起的细胞毒性。截然不同的是，LRRK2 基因G2019S突变小胶质细胞之间的病理性α-syn转移和线粒体交换均受到显著影响，并且LRRK2 G2019S突变是家族性PD最为常见的遗传因素【10】。因此，可以推测，LRRK2 G2019S突变可能通过阻碍病理性α-syn转移和线粒体交换导致家族性PD。

文中，作者深入研究了病理性α-syn在小胶质细胞之间转移的过程，同时证实这一现象在体外、体内以及DLB患者中都普遍存在。那么，其他种类的错误折叠蛋白，比如病理性tau，是否也有在小胶质细胞之间转移的现象？另外，研究表明病理性α-syn主要存在于神经元中，同时能够在神经元之间传播并推动疾病发展。那么，小胶质细胞和神经元之间是否也存在本文中类似的病理性α-syn转运现象和机制？都是值得进一步研究的问题。

最后，作者利用人工合成的α-syn原纤维指征病理性α-syn，并深入研究其被小胶质细胞吞噬后转移的过程。盛赞这项工作新颖的同时，也有值得我们进一步讨论的地方，第一：尽管α-syn原纤维是α-syn单体的聚集状态，但是，此前研究表明，临床患者的病理性α-syn高度异质【11, 12】，因此，人工合成的α-syn原纤维能否具备代表病理性α-syn的能力值得商榷。第二：作者利用荧光标记的α-syn原纤维，研究小胶质细胞的吞噬和转移，但是，考虑到α-syn原纤维可能会附着在小胶质细胞的表面，因此，可能会导致结果有所偏差。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.09.007

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参考文献（上下滑动查看）  

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制版︱王思珍

本文完